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mMESSAGE mMACHINE^® Kit

 

— — High Yield Capped RNA Transcription Kit

 

Data from GeneBio , mRNA for injection & transfection

 

原 理：

轉錄試劑盒是專(zhuān)門(mén)設計用于體外高產(chǎn)量合成帽狀RNA（即合成RNA的5端帶帽狀結構），帽狀RNA模擬了大多數真核生物體內發(fā)現的mRNA結構。試劑盒內的帽狀類(lèi)似物[m7G(5)ppp(5)G]與4種核苷酸混合在單一溶液內，簡(jiǎn)化了反應步驟。另外帽狀類(lèi)似物：GTP經(jīng)優(yōu)化設計為1:4，最大化轉錄生成RNA和帽狀RNA所占比例。20ul的反應體系加入1µg DNA模板在2h內可以體外合成15-35 µg 7-甲基鳥(niǎo)苷帽狀RNA，其產(chǎn)量是傳統體外轉錄反應的10-50倍。

優(yōu) 勢：

1）一步法直接合成帶帽狀結構的RNA，其結構與大多數真核生物體內的mRNA結構相同；

2）試劑盒內酶混合液含RNase抑制劑，保護RNA不被降解；

3）試劑盒含對照模板（ Xenopus elongation factor 1a, pTRI Xef），以檢測試劑盒的轉錄效率；

應 用：

帽狀RNA可直接用于下游實(shí)驗：顯微注射入卵母細胞，體外翻譯，轉染或者其他。

試劑盒成分：（25 reactions）

1.75 ml， Nuclease-free Water。

50 μL Enzyme Mix (SP6, T7, or T3)，50%甘油緩沖液含RNA聚合酶、Rnase抑制劑和其他。

50 μL，10X Reaction Buffer (SP6, T7, or T3) ，含鹽類(lèi)、緩沖液、DTT和其他成分。

250μL，2X NTP/CAP (SP6, T7, or T3)，一種中性緩沖液含有ATP/CTP/UTP/GTP/帽狀類(lèi)似物。

100μL GTP，20 mM in SP6 Kits; 30 mM in T3 and T7 Kits。

100 μL，TURBO DNase (2 U/μL)。

10 μL，pTRI-Xef, 0.5 mg/mL (Control Template)。

1 ml，Ammonium Acetate Stop Solution。

1.4 mL，Lithium Chloride Precipitation Solution。

1.4 mL，Gel Loading Buffer II。

實(shí)驗材料（自行準備）：

DNA模板：待轉錄的DNA序列上游必須帶有正確的RNA聚合酶啟動(dòng)位點(diǎn)（T7，T3或SP6）；

標記核苷酸(選擇性)：[α-³²P] UTP or [α-³²P]CTP可加入反應體系用作追蹤元素，方便定量檢測RNA合成量；

合成RNA純化試劑（選擇性）：緩沖液或飽和酚/氯仿，異丙醇，離心柱；

DNA模板（注意事項）：

（1）試劑盒選擇：根據帶轉錄的DNA序列上游帶有的RNA聚合酶啟動(dòng)位點(diǎn)（T7，T3或SP6）選擇對應的試劑盒；

（2）模板濃度：推薦使用0.5 μg/μL水溶液或TE溶液；

（3）模板大?。鹤罴验L(cháng)度是0.3-5.0kb，可用于更長(cháng)或更短的模板，需適當調整反應條件；

（4）模板方向：若合成sense RNA(正義RNA)，使用RNA聚合酶對應的細菌啟動(dòng)子在5端或者蛋白質(zhì)編碼區的N末端；如果模板含有質(zhì)粒，經(jīng)多克隆位點(diǎn)內切酶線(xiàn)性化后啟動(dòng)子處于相反位置；若合成antisense RNA（反義RNA），使用RNA聚合酶對應的細菌啟動(dòng)子在3或者蛋白質(zhì)編碼區的C末端；

產(chǎn)品信息：現貨供應！

 

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