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貨號

規格

價(jià)格

ECL-100

100ml

450

檢測方法

MTT法

XTT法

WST-1法

CCK法

甲臜產(chǎn)物的水溶性

差（需加有機溶劑溶解再檢測）

好

好

好

產(chǎn)品性狀

粉末

2瓶溶液

溶液

1瓶溶液

使用方法

配成溶液后使用

現配現用

即開(kāi)即用

即開(kāi)即用

檢測靈敏度

高

很高

很高

高

檢測時(shí)間

較長(cháng)

較短

較短

最短

檢測波長(cháng)

560-600nm

420-480nm

420-480nm

430-490nm

細胞毒性

高，細胞形態(tài)完全消失

很低，細胞形態(tài)不變

很低，細胞形態(tài)不變

很低，細胞形態(tài)不變

試劑穩定性

一般

較差

一般

很好

批量樣品檢測

可以

非常適合

非常適合

非常適合

便捷程度

一般

便捷

便捷

非常便捷

問(wèn) 題

回 答

一個(gè)孔中應接種多少個(gè)細胞？

當使用標準96孔板時(shí)，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔 (100μl 培養基)。檢測白細胞時(shí)的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 (100μl 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK8溶液。

能否用384孔板進(jìn)行試驗？

可以。向各孔中加入培養基體積10%的CCK8溶液，如果加入的CCK8體積太少，可以先將CCK8溶液稀釋1倍，然后加入培養基體積20%的量。

能否用24孔板進(jìn)行試驗？

可以。向各孔中加入培養基體積10%的CCK8溶液。

酚紅會(huì )影響檢測嗎？

不會(huì )。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時(shí)，通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì )對檢測造成影響。

CCK8與胸苷結合檢測之間是否有相關(guān)性？

有。然而，請注意由于CCK8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此結果可能不同。

CCK8能否檢測細菌細胞？

可以檢測E.coli，但不能檢測酵母細胞。向100μl E.coli培養液中加入10μl CCK8溶液，并培養1-4個(gè)小時(shí)或過(guò)夜。

CCK8穩定嗎？

CCK8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要長(cháng)期保存，我們推薦-20℃的儲藏條件。

如果沒(méi)有450 nm的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？

還可使用450 nm到490 nm之間的濾光片。

如何減少由于CCK8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來(lái)的誤差？

可以在加樣前用培養基稀釋CCK8試劑并混勻后加樣。

CCK8是什么顏色？

應該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會(huì )影響測定。

CCK8能否對活細胞進(jìn)行染色？

不能。因為CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST8)，并通過(guò)電子載體PMS將活細胞中的電子交換到培養基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK8不能對細胞進(jìn)行染色。

CCK8檢測溶液對細胞是否有毒？

CCK8溶液自身因為高濃度的PMS的存在而具有一點(diǎn)毒性。但是，加到培養基中的CCK8是沒(méi)有毒性的，因為被稀釋了10倍。因此，長(cháng)時(shí)間的培養，如過(guò)夜或者培養數天是可以的。同一個(gè)細胞培養液在CCK8檢測后還可以用于其他細胞增殖檢測，如結晶紫檢測，中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于CCK8的耐受力都不同，因此在需要進(jìn)行長(cháng)時(shí)間培養時(shí)，先檢測一下細胞在加入CCK8培養后的活力。

在做加藥實(shí)驗時(shí)，藥物對測定是否有影響？如何解決？

有時(shí)會(huì )有影響。如果藥物具有還原性，會(huì )和CCK8發(fā)生顯色反應，增加吸光度。解決辦法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養基中加入CCK8，測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養基 (加CCK8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK8之前更換培養基，去掉藥物的影響。

每次測定的數值不一樣，是什么原因？如何解決？

可能會(huì )有以下幾個(gè)原因： 1. 當在培養箱內培養時(shí)，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。 一般情況下，最外一圈的孔只加培養基，不作為測定孔用。 2. 有可能會(huì )因為CCK8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在加入CCK8后，輕輕敲擊培養板以幫助混勻。 3. 每孔的細胞數量過(guò)多或過(guò)少。請預先在1,000-100,000個(gè)/孔范圍內摸索條件。

如何設定空白對照？

在不含細胞的培養基中加入CCK8，培養一定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實(shí)驗(細胞毒性實(shí)驗)時(shí)，還應考慮藥物的吸收，可在不含細胞，加入藥物的培養基中加入CCK8，培養一定的時(shí)間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。

哪些物質(zhì)會(huì )影響CCK8的測定？

當有還原性物質(zhì)存在時(shí)會(huì )影響CCK8的測定，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養基中的量不多，酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下，會(huì )增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。

在實(shí)驗中吸光度值太高，如果不能減少細胞數量，如何解決？

可以縮短加入CCK8后的培養時(shí)間。例如：可以把加入CCK8試劑后的培養時(shí)間由2小時(shí)縮短為1小時(shí)。

設定參比波長(cháng)的目的是什么？必須設定嗎？

不一定要設定。CCK8試劑在參比波長(cháng)沒(méi)有吸光度。設定參比波長(cháng)的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來(lái)的吸收。

說(shuō)明書(shū)上僅寫(xiě)了96孔板的測定方法，如果使用24孔板或12孔板，應該加多少量CCK8試劑？

一般情況下建議加入CCK8試劑的量是培養基體積的1/10。

在CCK8顯色過(guò)程中，如何終止反應？

有一下幾種方法（96孔板）： ①在顯色反應后，將培養板放置4℃冰箱內。②每孔加10μl 0.1 M HCL溶液。③每孔加10μl的 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反應停止后，應在24小時(shí)之內測定。

必須預培養細胞嗎？

不一定。如果要向保持細胞的最好狀態(tài)，建議預培養細胞。如果不做細胞預培養，細胞內的脫氫酶可能會(huì )不穩定。也有人不做細胞預培養，但在做標準曲線(xiàn)和檢測時(shí)需要統一檢測條件。

如果加入的藥物中含有金屬，是否會(huì )有影響？

金屬對CCK8顯色有影響。當終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì )抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話(huà)，將會(huì )100%抑制。

CCK8試劑的保存條件？

在避光條件下CCK8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長(cháng)時(shí)間的話(huà)，推薦在-20℃下保存。但是CCK8若反復解凍和冰凍將會(huì )增加空白吸收，從而影響檢測結果，若經(jīng)常使用可將試劑存放在4℃冰箱內保存。

預培養后，更換培養基需要細胞計數嗎？

一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長(cháng)期的細胞，用血球計數盤(pán)計數，制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數細胞的話(huà)，可以預培養后取培養基用血球計數盤(pán)進(jìn)行計數。

CCK8對于不同的細胞，靈敏度是否一樣？

不一樣，懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般加入CCK8培養1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過(guò)延長(cháng)CCK8的加入時(shí)間或增加細胞數量來(lái)解決。

懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區別？

懸浮細胞由于染色比較困那，一般需要增加細胞數量和延長(cháng)培養時(shí)間。貼壁細胞染色比較容易，若細胞數量過(guò)大，有時(shí)吸光度會(huì )超過(guò)酶標儀的讀數。

應該每次做標準曲線(xiàn)嗎？

建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態(tài)不一定一樣，對于狀態(tài)不一樣的細胞，建議每次做標準曲線(xiàn)。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會(huì )有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標準曲線(xiàn)。

有時(shí)在藥物作用情況下，細胞已經(jīng)死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計算細胞數量？

不能。由于CCK8是通過(guò)和細胞內的脫氫酶進(jìn)行反應間接反映活細胞數量，如果細胞已經(jīng)死亡，但脫氫酶的活性還在，則試劑測定的細胞數量將會(huì )比真實(shí)值高，不能真實(shí)反映活細胞數量，建議采用別的方法測定。

實(shí)驗之前，是否需要先檢測一下培養基和CCK8是否會(huì )反應？

需要，可用一個(gè)孔檢測一下，因為有培養基中可能含有氧化還原反應的物質(zhì)，在正式實(shí)驗之前有必要先確認培養基和CCK8是否反應。一般正常在的OD值應該在0.4以下。

如果OD值太低，可以采取什么辦法？

可以采取2個(gè)辦法：① 適當增加細胞數量。② 延長(cháng)加入CCK8試劑后的染色時(shí)間。